Принцип ПЦР исследования

Что представляет собой полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый из нас на каком-то этапе жизни сталкивается с данной технологией, даже не осознавая этого. ПЦР анализирует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на совершенно новый уровень, что позволило проводить точную диагностику различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, определение отцовства и даже клонирование генов. ПЦР находит широкое применение в криминалистике, археологии и других направлениях, так как источником ДНК может служить капля крови, оставшаяся на месте преступления, или волос человека, а также останки мумии или мамонта, находившиеся в земле тысячи, миллионы лет…

Сегодня мы сосредоточимся на ПЦР как точном инструменте диагностики инфекций, который справедливо получил титул «золотой стандарт». Этот метод основывается на обнаружении ДНК микроорганизмов, что позволяет точно определить «личность» микроба, вызвавшего заболевание.

Как работает ПЦР

Из курса биологии всем известно, что генетический материал всех живых организмов на Земле представлен двумя цепочками молекулы ДНК (за исключением некоторых вирусов, у которых есть РНК). Каждая из этих цепочек ДНК состоит из сочетаний четырех нуклеотидов. Да, нуклеотидов всего четыре, но именно из них образован генетический материал всех живых существ. Различие заключается лишь в конкретной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в определенном участке ДНК искомого микроорганизма, можно его обнаружить в любом биологическом материале.

Основной принцип ПЦР состоит в многократном увеличении (амплификации) фрагмента ДНК с использованием специфических ферментов.

Почему реакция называется полимеразная цепная?

ПЦР – это сложный и высокотехнологичный процесс. Для проведения реакции применяется шаблонная ДНК (стартовая) и праймеры – короткие цепочки синтезированной ДНК, которые связываются с шаблонной ДНК. Первоначально происходит разъединение двухцепочечной ДНК (образца) при высоких температурах, затем праймеры присоединяются к одноцепочечной матрице. После этого фермент ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК (полимер) из нуклеотидов (мономеров). Количество фрагментов увеличивается в геометрической прогрессии, откуда происходит название «цепная реакция». В качественном методе для выявления синтезированной ДНК используют специальные метки. Если ДНК микроба обнаружена, произойдёт свечение. Если ПЦР не была инициирована, значит, свечения не будет, и текущего возбудителя в исследуемом образце нет. Количественные тесты выполняются в режиме реального времени (ПЦР real time), когда число копий ДНК фиксируют оптические датчики, встроенные в устройство — амплификатор.

Преимущества ПЦР

1. Высокая специфичность. Происходит копирование конкретного заданного участка, принадлежащего тому микроорганизму, который мы хотели бы обнаружить. При отсутствии молекул нужной ДНК реакция не пойдёт, даже если в растворе окажутся тысячи других ДНК.
2. Высокая чувствительность. ДНК возбудителя будет выявлено даже при наличии минимального количества микроорганизма. Поэтому ПЦР выявляет скрыто протекающие инфекции
3. Возможно исследование любого биологического материала
4. Проведение ПЦР возможно в случаях, когда объем материала минимален. Это актуально в педиатрии, офтальмологии, неврологии, судебно-медицинской экспертизе.
5. ПЦР выявляет микроорганизмы, не вырастающие в бакпосевах. Их называют труднокультивируемые и к ним относят все вирусы, хламидии, микоплазмы и т.д.
6. ПЦР называют прямым методом, поскольку он выявляет возбудителя, а не иммунную реакцию организма, и является подтверждающим методом в диагностике инфекционных заболеваний

Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:

ПЦР обнаруживает ДНК патогена независимо от его состояния — живой или мёртвый, поэтому:

• Для правильной расшифровки результата необходимо сопоставлять клинические данные и результаты ПЦР, с чем лучше всего справится врач.
• Для оценки эффективности лечения ПЦР проводится не ранее чем через месяц после окончания антибактериальной терапии (чтобы возбудитель полностью вывелся из организма)

Для обнаружения ДНК внутриклеточных инфекционных организмов (например, вирусов) необходимы клетки, поэтому:

• При исследовании материала урогенитального тракта важно соблюдать интервал 5-7дней между повторными мазками, чтобы клетки успели восстановиться

Слизь, кровь и гной способны препятствовать проведению реакции ПЦР, поэтому:

• Нельзя проводить исследование материала урогенитального тракта во время менструации
• Перед исследованием важно очистить нос, зев и другие локусы от слизи и гноя

Для выполнения ПЦР необходимо строгое соблюдать условия технологии, поэтому в лаборатории KDL:

• Используются вакуумные системы для взятия крови, чтобы избежать контаминации (попадания ненужной ДНК) и применяются специальные расходные материалы (эппендорфы) для других биоматериалов
• Имеется собственная ПЦР лаборатория, работающая по международным стандартам.

Берегите здоровье и проходите обследования в той лаборатории, которой вы доверяете!

Список источников:

1. Waller JV, Kaur P, Tucker A, Lin KK, Diaz MJ, Henry TS, Hope M. Diagnostic tools for Coronavirus disease (COVID-19): Comparing CT and RT-PCR viral nucleic acid testing. AJR Am J Roentgenol. 2020;215(4):834-838. https://doi.org/10.2214/ AJR.20.23418
2. Long C, Xu H, Shen Q, Zhang X, Fan B, Wang C, Zeng B, Li Z, Li X, Li H. Diagnosis of the Coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT? Eur J Radiol. 2020;126:108961. https://doi. org/10.1016/j.ejrad.2020.108961
3. Волков А.Н., Начева Л.В. Молекулярно-генетические методы в практике современных медико-биологических исследований. Часть I: Теоретические основы ПЦР-диа-гностики. Фундаментальная и клиническая медицина. 2020;5(4):133-140 [Volkov AN, Nacheva LV. Molecular genetic techniques in current biomedical research. Part I: Theoretical basis of PCR-diagnostics. Fundamental and Clinical Medicine. 2020;5(4):133-140. (In Russ.).] https://doi. org/10.23946/2500-0764-2020-5-4-133-140
4. Pardee K, Green AA, Takahashi MK, Braff D, Lambert G, Lee JW, Ferrante T, Ma D, Donghia N, Fan M, Daringer NM, Bosch I, Dudley DM, O’Connor DH, Gehrke L, Collins JJ. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 2016;165(5):1255-1266. https://doi.org/ 10.1016/j.cell.2016.04.059